El templo es de una sola nave cubierta con bóveda de cañón con lunetos, tiene cuatro capillas laterales. Todo su interior está ricamente decorado con mármoles de varios colores y pinturas al fresco que reflejan la iconografía de la Virgen Madre de Dios. El presbiterio y las capillas están presididas por hermosos retablos dorados, entre ellos se destaca el retablo neobarroco del altar mayor por los detalles de orfebrería, en él se encuentra la virgen de la Esperanza Macarena del siglo XVII. El retablo tiene 12 metros de altura y además de la virgen, cuenta con una alegoría a las tres virtudes Teologales Cristianas.

Otros espacios de interés dentro de la Basílica de la Macarena son; la Capilla del Rosario dónde se encuentra la Virgen del Rosario con el Niño Jesús, el altar de la Hispanidad presidido por una pintura de la virgen de Guadalupe y la capilla de la sentencia dedicada a la imagen de Nuestro Padre Jesús de la Sentencia del siglo XVII.